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組織芯片制備

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組織芯片制作方法流程

2020-06-22

組織芯片的出現,與基因芯片配合使用在尋找疾病基因中有很好的互補作用。在腫瘤研究中發揮著重要作用。將基因芯片篩選出的基因作成探針,再將探針與組織芯片中眾多的腫瘤組織進行熒光原位雜交,尋找腫瘤發生發展的相關因素。


組織芯片又稱組織微陣列,主要用于研究同一種基因或蛋白質分子在不同細胞或組織中表達的情況。是將數十至上千個小組織整齊地排列在一張載玻片上而制成的組織切片,它是繼基因芯片、蛋白質芯片之后出現的又一種重要的生物芯片。




那么組織芯片是如何制作的呢



一、組織芯片制作的一般過程



1、選取待研究的組織?,F在人們利用組織芯片技術對人體各組織均有研究,包括肝臟,前列腺,心臟,乳房等等,據相關數據顯示,在大腦組織中的應用最多。醫學上常選取一些病變器官進行研究。根據制作方法來分,微陣列主要有石蠟包埋的組織微陣列和冰凍微陣列兩種。


2、經檢測后標記出待研究的區域。組織微陣列的檢測儀主要是高性能顯微鏡、熒光顯微鏡或共聚焦熒光顯微鏡。適用的檢測技術有蘇木精—HE染色,免疫組織化學(IHC)染色,原位雜交(ISH),熒光原位雜交(FISH),原位PCR,寡核苷酸啟動的原位DNA合成(PRINS)等。


3、使用組織芯片點樣儀將標記好的組織按設計排列在空白蠟塊上。首先要利用打孔機在已經標記好的靶位點上進行打孔,將組織芯轉入蠟塊孔中,重復操作可轉入上千個樣品組織芯。


4、使用切片機對陣列蠟塊進行連續切片即獲得組織芯片。根據制作方法來分,微陣列主要有石蠟包埋的組織微陣列和冰凍微陣列兩種。后者可以克服上述前者的多種缺陷(含醛基的化合物(可能損傷RNA或使目標抗原結構斷裂或破壞抗原——抗體結合位點,另外,石蠟包埋乙醇固定過的組織也無法避免RNA降解)。



二、組織芯片制作流程實例



通過組織芯片制作機細針打孔的方法,從眾多的組織蠟塊(稱為供體蠟塊,donor)中采集到數十至上百的圓柱形小組織(組織芯,tissue core),并將其整齊排列另一空白蠟塊(稱為受體蠟塊,recipient)中,而制成組織芯片蠟塊。然后對組織芯片蠟塊進行切片,再將切片轉移到載玻片上制成組織芯片。


1、芯片微陳列設計:在構建組織芯片之前,應該預先計劃檢測多少樣本,然后相應地進行設計。對大多數研究來說,在一個常規的載玻片上放置60~100個樣本已經足夠了。當樣本超過100例時,上樣、切片、染色及研究各個步驟都要求相當熟練,并且由于樣本排列過于緊密,有可能導致芯片制作和研究失敗。因此在計劃檢測數百個到上千標本時可考慮多做幾個組織芯片。


2、收集病例及相關蠟塊:挑選出具有隨訪資料的不同發展階段的腫瘤組織蠟塊,根據HE切片對石蠟標本中有代表性的點進行標記,包括典型的腫瘤和相應的正常組織,以構建腫瘤組織芯片。


3、TMA受體蠟塊制備:取97.5克萊卡石蠟+2.5克蜂蠟(2.5%)混合,制成長36mm*寬26mm*高17mm的空白蠟塊,在該蠟塊20mm×16mm范圍內設計10×8點組織陳列。組織四周預留0.5cm-0.7cm空間,用組織儀打孔制成TMA蠟塊。


4、在組織芯片制作機上用細針對受體蠟塊打孔,孔徑以1~1.5mm比較適宜。


5、同樣在供體蠟塊上標記的相應部位打孔采集組織芯??讖酵瑯訛?~1.5mm。


6、將組織芯轉移到受體模塊的孔中,每個組織芯之間的間距以0.2mm為佳。


7、為了防止在打點、切片、染色或免疫組化過程中出現漏點,滑片及掉片現象,每個樣本可以上樣1-2個點。


8、將構建好的TMA芯片蠟塊放在相宜的塑料盒子內,并嚴密固定防止移位。放入55℃溫箱中約10分鐘,在蠟將要完全溶解前,取出室溫下冷卻,使受體模塊的蠟與新插入的小圓柱狀組織溶為一體,取下蠟塊,于4℃冰箱中保存備用。


9、切片前,蠟塊需在4℃中預冷4h左右,然后夾在切片機上進行修正,等修到全部組織完整為止。用-20℃預冷冰袋貼在蠟塊上5-10min左右,快速連續切片30-50張左右,再用冰袋冷凍組織塊,或直接在冰凍切片機內進行,直至將組織切完為止。將4μm連續切片分別漂在涼水中,讓其自然展開,按順序將切片轉移至45℃的溫水中展片2min左右,將其貼在浸有APES切片黏合劑的載玻片上晾干,60℃中烤片3min左右,58℃中繼續烤片18h,-20℃保存備用。


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